(واکنش زنجیره ای پلیمراز) چیست؟
PCR تکنیکی است که در آزمایشگاه برای تولید میلیون ها نسخه از یک بخش خاص از DNA استفاده می شود. اولین بار در دهه 1980 توسعه یافت.
PCR چیست؟
واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) در ابتدا در سال 1983 توسط بیوشیمیست آمریکایی Kary Mullis توسعه یافت. وی در سال 1993 جایزه نوبل شیمی را به دلیل فعالیت پیشگامانه خود دریافت کرد.
PCR در زیست شناسی مولکولی برای ساختن نسخه های زیادی از (تقویت) بخشهای کوچک DNA استفاده می شود؟ یا ژن ؟. با استفاده از PCR می توان هزاران تا میلیون ها نسخه از بخش خاصی از DNA را از مقدار بسیار کمی از DNA تولید کرد.
PCR یک ابزار رایج است که در آزمایشگاه های تحقیقات پزشکی و بیولوژیکی مورد استفاده قرار می گیرد. در مراحل اولیه پردازش DNA برای تعیین توالی ، تشخیص وجود یا عدم وجود ژن برای کمک به شناسایی عوامل بیماری زا در طول عفونت ، و هنگام ایجاد پروفایل DNA پزشکی قانونی از نمونه های کوچک DNA استفاده می شود.
PCR چگونه کار می کند؟
اصول پشت هر PCR ، هر نمونه DNA ، یکسان است. پنج عنصر اصلی برای راه اندازی PCR مورد نیاز است. ما دقیقاً توضیح می دهیم که هر کدام از اینها در ادامه کار چه می کنند.
قالب DNA که باید کپی شود آغازگرها ، قسمتهای کوتاهی از DNA که واکنش PCR را آغاز می کند ، طراحی شده است تا به دو طرف قسمتی از DNA که می خواهید کپی کنید متصل شود.
بازهای نوکلئوتیدی DNA (همچنین به عنوان dNTP شناخته می شود). پایه های DNA (A ، C ، G و T) بلوک های سازنده DNA هستند و برای ساخت رشته جدید DNA مورد نیاز هستند.
آنزیم تاق پلیمراز برای افزودن پایه های جدید DNA بافر برای اطمینان از شرایط مناسب برای واکنش. PCR شامل فرآیند گرمایش و سرمایش به نام چرخه حرارتی است که توسط ماشین انجام می شود.
سه مرحله اصلی وجود دارد: دناتوره شدن-هنگامی که DNA الگوی دو رشته ای گرم می شود تا آن را به دو رشته جدا کند. آنیل - هنگامی که دما کاهش می یابد تا آغازگرهای DNA بتوانند به الگوی DNA متصل شوند. تمدید - هنگامی که دما افزایش می یابد و رشته جدید DNA توسط آنزیم Taq پلیمراز ساخته می شود.
این سه مرحله 20-40 بار تکرار می شود و هر بار تعداد کپی DNA را دو برابر می کند.
یک واکنش کامل PCR را می توان در چند ساعت یا حتی کمتر از یک ساعت با برخی از ماشینهای با سرعت بالا انجام داد.
پس از تکمیل PCR ، می توان از روشی به نام الکتروفورز برای بررسی کمیت و اندازه قطعات DNA تولید شده استفاده کرد.تصویری که مراحل اصلی واکنش زنجیره ای پلیمراز (PCR) را نشان می دهد.
در هر مرحله از PCR چه اتفاقی می افتد؟
مرحله دناتوره شدن در این مرحله کوکتل حاوی الگوی DNA و سایر مواد اصلی دیگر تا 95-94 درجه سانتی گراد گرم می شود.
دمای بالا باعث پیوندهای هیدروژنی می شود؟
بین پایه ها در دو رشته DNA الگو شکسته شده و دو رشته جدا شوند. این امر منجر به ایجاد دو رشته DNA می شود که به عنوان الگویی برای تولید رشته های جدید DNA عمل خواهند کرد.
این مهم است که دما در این مرحله به مدت طولانی حفظ شود تا اطمینان حاصل شود که رشته های DNA به طور کامل جدا شده اند. این معمولا بین 15-30 ثانیه طول می کشد. مرحله پخت در این مرحله واکنش تا دمای 65-50 درجه سانتیگراد سرد می شود. این باعث می شود که آغازگرها به وسیله پیوند هیدروژنی به محل خاصی در DNA قالب تک رشته ای متصل شوند (دمای دقیق بستگی به دمای ذوب آغازگرهایی که استفاده می کنید).
آغازگرها تک رشته DNA یا RNA هستند؟
دنباله ای که حدود 20 تا 30 پایه دارند.
آغازگرها مکمل یکدیگر طراحی شده اند؟
به ترتیب به بخشهای کوتاه DNA در هر انتهای دنباله که باید کپی شود. پرایمرها به عنوان نقطه شروع سنتز DNA عمل می کنند. آنزیم پلیمراز فقط می تواند بازهای DNA را به دو رشته DNA اضافه کند. تنها پس از اتصال پرایمر ، آنزیم پلیمراز می تواند متصل شود و رشته جدید تکمیلی DNA را از بازهای DNA شل شروع کند. دو رشته جدا شده DNA مکمل یکدیگرند و در جهت مخالف حرکت می کنند (از یک سر - انتهای 5 ' - تا سر دیگر - انتهای 3'). در نتیجه ، دو آغازگر وجود دارد - آغازگر جلو و آغازگر معکوس.
این مرحله معمولاً حدود 10 تا 30 ثانیه طول می کشد. مرحله تمدید در این مرحله نهایی ، حرارت تا 72 درجه سانتی گراد افزایش می یابد تا DNA جدید توسط آنزیم Taq DNA Polymerase مخصوص که بازهای DNA را اضافه می کند ، ساخته شود.
Taq DNAPolymerase آنزیمی است که از باکتری های گرما دوست گرفته شده است؟ Thermus aquaticus
این باکتری به طور معمول در چشمه های آب گرم زندگی می کند بنابراین می تواند دمای بالای 80 درجه سانتیگراد را تحمل کند. DNA پلیمراز باکتری در دماهای بالا بسیار پایدار است ، به این معنی که می تواند در دمای مورد نیاز برای شکستن رشته های DNA در مرحله تغییر رنگ PCR مقاومت کند.
DNA پلیمراز اکثر موجودات دیگر قادر به تحمل این درجه حرارت بالا نیست ، به عنوان مثال ، ویروس پلیمراز انسانی
