کاربردهای تشخیص مولکولی در علم پزشکی قانونی

H.E. مک کیرنان، پی.بی. دانیلسون، در تشخیص مولکولی (نسخه سوم)، 2017
21.3.4 استخراج دیفرانسیل

استخراج دیفرانسیل یک تکنیک استخراج اصلاح شده است که امکان لیز انتخابی و جداسازی DNA از مخلوطی از اسپرم و سلول های اپیتلیال را فراهم می کند . نمونه‌های پزشکی قانونی، مانند نمونه‌های کیت‌های تجاوز جنسی، ممکن است حاوی سلول‌های اسپرم مردانه باشند که با سلول‌های اپیتلیال زن و مرد مخلوط شده‌اند. به طور کلی، این سلول های اسپرم مردانه هستند که بیشترین ارزش پزشکی قانونی را دارند. تکنیک های استخراج دیفرانسیل امکان جداسازی فیزیکی انتخابی بخش نر را قبل از پروفایل DNA فراهم می کند (Yoshida et al., 1995). در طول استخراج افتراقی، سلول های اپیتلیال ابتدا به طور انتخابی از طریق افزودن SDS و پروتئیناز K لیز می شوند. سلول های اسپرم به طور کلی در برابر لیز توسط این مواد شیمیایی مقاوم هستند. هنگامی که سلول های اپیتلیال لیز شدند، از سانتریفیوژ برای گلوله کردن انتخابی سلول های اسپرم دست نخورده استفاده می شود. سپس DNA حاوی رویی از سلول های اپیتلیال نر و ماده را می توان در یک لوله جداگانه خارج کرد. سپس سلول های اسپرم جدا شده با افزودن SDS، پروتئیناز K و دی تیوتریتول (DTT) لیز می شوند. DTT پیوندهای دی سولفید موجود در غشای هسته اسپرم را کاهش می دهد و DNA سلول اسپرم را آزاد می کند. سپس DNA موجود در بخش سلول های اپیتلیال جداگانه و بخش سلول اسپرم را می توان با روش های آلی یا غیر آلی جدا کرد. این روش استخراج می تواند تفسیر نتایج پروفایل DNA را با افزایش احتمال به دست آوردن پروفایل DNA مردانه واضح از بخش اسپرم ساده کند. از آنجایی که بخش اپیتلیال حاوی DNA نر و ماده است، ممکن است همچنان به صورت مخلوط DNA وجود داشته باشد. لازم به تاکید است که این یک رویکرد قبل از PCR است که به طور فیزیکی سلول‌های مرد را برای تجزیه و تحلیل STR اتوزومال جدا می‌کند، که قدرت تشخیص برتری را ارائه می‌دهد. این در تضاد با استفاده از Y-STR ها است که به سادگی از نشانگرهای ژنتیکی هدفمند مردانه برای تقویت انتخابی DNA مردانه در حضور DNA اضافی ماده استفاده می کنند.


 تصویری از گردش کار استخراج افتراقی، که به تحلیلگران اجازه می دهد DNA سلول های اپیتلیال را از DNA سلول اسپرم تقسیم کنند. این روش استخراج DNA از پیوندهای دی سولفیدی پروتئین در غشای خارجی اسپرم استفاده می کند که آنها را نسبت به سلول های اپیتلیال در برابر لیز مقاوم تر می کند. سلول‌های اپیتلیال که معمولاً برای پردازش شواهد تجاوز جنسی استفاده می‌شوند، ابتدا لیز می‌شوند و اسپرم‌های دست نخورده باقی می‌مانند که به آسانی با سانتریفیوژ پلت می‌شوند. برداشتن لیزات سلول های اپیتلیال به یک لوله جداگانه، گلوله ای را به جای می گذارد که برای اسپرم غنی شده است. دناتوره شدن بعدی پیوندهای دی سولفید پروتئین توسط دی تیوتریتول، لیز سلول های اسپرم را برای استخراج DNA تسهیل می کند. DTT، دی تیوتریتول؛ SDS، سدیم دودسیل سولفات.
متابولیسم اینوزیتول فسفولیپید و فسفاتیدیل اینوزیتول کینازها


گلیکان‌های PtdIns رایگان ممکن است از سلول‌های دارای برچسب متابولیکی با روش‌های استخراج لیپید معمولی بازیابی شوند. طبق گفته منون (1994) یک پروتکل استخراج افتراقی با استفاده از کلروفرم/متانول (2:1، حجم/حجم) و کلروفرم/متانول/آب (10:10:3، جلد) به ویژه در تقسیم کردن لیپیدها به دو دسته کلی مفید است. دسته بندی بر اساس قطبیت سپس می توان گونه های منفرد در هر عصاره را با استفاده از TLC، کروماتوگرافی تبادل آنیونی و/یا کروماتوگرافی برهمکنش آبگریز جدا کرد.

برای استخراج لیپید، 1.5 میلی لیتر کلروفرم/متانول سرد یخی (Folch et al., 1957) به سلول های پلت شده در یک لوله شیشه ای اضافه می شود. این باید برای حفظ یک فاز کافی باشد. با هم زدن با پیپت پاستور طولانی مخلوط کنید. گرداب یا تکان نخورید. نمونه را سانتریفیوژ کنید (1500 گرم، 10 دقیقه) تا زباله ها گلوله شوند، مایع رویی کلروفرم/متانول را با دقت (با استفاده از پیپت پاستور) خارج کنید و استخراج را چندین بار تکرار کنید. عصاره ها را مخلوط کرده و روی یخ بگذارید. فرآیند استخراج را با هم زدن بقایای سلولی نیمه‌ریزش شده با 1 میلی‌لیتر کلروفرم/ متانول/آب سرد یخی (10:10:3، حجم) ادامه دهید. آلاینده های محلول در آب را هم در کلروفرم/ متانول و هم در عصاره کلروفرم/ متانول/آب با روش های شستشوی جداگانه حذف کنید. برای عصاره کلروفرم/ متانولی، 0.2 جلد اضافه کنید. از 4 میلی مولار MgCl2، گردابی برای مخلوط کردن، و جداسازی فازها با سانتریفیوژ. فاز بالایی را بردارید و فاز پایینی غنی از کلروفرم حاوی چربی را با فاز بالایی ساختگی که با مخلوط کردن کلروفرم/متانول تازه با MgCl2 4 میلی مولار در یک لوله جداگانه تهیه شده است، دوباره استخراج کنید. عصاره کلروفرم / متانول / آب باید با خشک کردن در Speedvac و معلق کردن مجدد باقیمانده با گرداب کردن در 500 میکرولیتر n-بوتانول و آب و سانتریفیوژ کردن برای جداسازی فازها پردازش شود. لیپیدها به طور کمی در فاز بالایی و غنی از بوتانول بازیابی می شوند (Menon، 1994). لیپیدها در chl